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Mariotte war zunächst katholischer Geistlicher in Dijon, wo er als Prior von St. Martin sous-Beaume wirkte. Seit der Gründung der Akademie der Wissenschaften 1666 lebte er in Paris und arbeitete zu Problemen der Flüssigkeiten und Gase. Mit seinem Namen ist das Boyle-Mariotte-Gesetz verbunden.
Daneben entdeckte er den blinden Fleck im menschlichen Auge. Mariotte interessierte sich auch für die Erdatmosphäre, für deren Verständnis er den Wasserkreislauf, den Regen (wie entstehen Regentropfen?) und den Höhendruck untersuchte.
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