| Infos Home | Impressum | Original Artikel & Autoren Liste |
Die Sequenzierung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, wobei es drei praktisch verwendbare Methoden zur Bestimmung der eigentlichen Nukleotidabfolge gibt. An die Sequenzierung schließt sich in der Regel die DNA-Sequenzanalyse an.
Sequenzierung im großen Maßstab, wie für das Humangenomprojekt stellte die bisher größte Herausforderung für die Bioinformatik dar.
| Inhalt |
|
1 Sequenzierungsmethoden
1.1 Maxam und Gilbert Methode
2 Hilfsmethoden1.2 Didesoxymethode nach Sanger 1.3 Sequenzierung durch Hybridisierung 3 |
Sequenzierungsmethoden
Maxam und Gilbert Methode
Die Methode der chemischen Spaltung nach Maxam und Gilbert (1977) diente ihren Erfindern zur erfolgreichen Bestimmung der Operon-Sequenz eines Bakteriengenoms. Sie wurde vedrängt von der zwar zeitgleich unabhängig entstandenen, aber schnelleren und leichter automatisierbaren
Didesoxymethode nach Sanger
Die Didesoxymethode wird auch "Kettenabbruch-Synthese" genannt und von Sanger um 1975 entwickelt und ebenfalls 1977 mit der ersten vollständige Sequenzierung eines Genoms (Bakteriophage φX174 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=870828&dopt=Abstract ) vorgestellt.
Man verwendet dazu heutzutage die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Klassischerweise werden in vier sonst gleichen Ansätze je eine unterschiedliche Base als Didesoxynukleotid (ddNTP) zugegeben. Ohne die Hydroxygruppe ist eine DNA-Verlängerung durch eine DNA-Polymerase nicht möglich und es kommt zum Kettenabbruch. Da die ddNTPs zufällig eingebaut werden, bricht die DNA-Synthese an verschiedenen Stellen ab. Nach der PCR wird jeder Ansatz getrennt mittels Gelelektrophorese getrennt und man kann die Sequenz anhand des Gels ablesen.
Seit Anfang der neunziger Jahre werden vorallem mit verschiedenen Fluoreszenz-Farbstoffen markierte Didesoxynukleotide eingesetzt, diese Modifikation erlaubt es alle vier Didesoxynukleotid, also alle vier Basen, in einer Reaktion, statt durch in vier getrennten durchzuführen. Das entstehende Produkt wird ebenfalls mittels Gelelektrophorese aufgetrennt und die dabei eingebauten Didesoxynukleotide werden dann durch einen Laserstrahl angeregt und entsenden infolge Fluoreszenz-Markierung Licht verschiedenen Farbe. Diese Veränderung ermöglicht auch die Automatisierung der DNA-Sequenzier, eine Vorausetzung für die vollständige Sequenzierung von großen Genomen, beispielsweise des Menschlichen oder des Genoms der Maus.
Sequenzierung durch Hybridisierung
Zu diesem Zweck werden auf einem Glasträger (DNA-Chip oder Microarray) kurze DNA-Abschnitte (Oligonukleotide) in Matrix-Anordnung fixiert. Die Fragmente der zu sequenzierenden DNA werden mit Farbstoffen markiert und das Fragmentgemisch wird auf der Oligonukleotidmatrix ausgebracht, so dass komplementäre fixierte und freie DNA-Abschnitte miteinander hybridisieren können. Nach dem Auswaschen ungebundener Fragmente lässt sich das Hybridisierungsmuster anhand der Farbmarkierungen und deren Intensität ablesen. Da die Sequenzen der fixierten Oligonukleotide und deren Überlappungsbereiche bekannt sind, kann man letztlich aus dem Farbmuster auf die zugrundeliegende Gesamtsequenz der unbekannten DNA rückschließen.
Hilfsmethoden
- sehr schöne Gesamtübersicht, nicht nur auf das Humangenom anwendbar
|
Der Ursprungsartikel stammt von der deutschsprachigen Wiki pedia (siehe oben: "Original Artikel & Autoren Liste"). Der Text steht unter der GNU Freie Dokumentation Lizenz. |